martes, 16 de agosto de 2011

PRACTICA DE BIOQUÍMICA PARA VETERINARIA No 10. OXIDACION MITOCONDRIAL DEL SUCCINATO

A REALIZARSE LA SEMANA 17 A 21 MARZO 2014



OXIDACION MITOCONDRIAL DEL SUCCINATO

OBJETIVO


El alumno demostrara la oxidación mitocondrial del succinato, utilizando un aceptor artificial de electrones, la cantidad del cual será determinada por espectrofotometría.


INFORMACION GENERAL

Los animales superiores son heterótrofos, es decir, no pueden sintetizar su propia energía (como lo hacen las plantas en la fotosíntesis), sino que deben ingerir esa energía en los alimentos que consumen, y posteriormente extraer parte de la misma mediante una compleja serie de reacciones bioquímicas.


La principal fuente de energía para los animales y el hombre son los carbohidratos, el metabolismo energético de estos compuestos incluye reacciones como la glucólisis, ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. Dependiendo de si las condiciones microambientales son aerobias (con presencia de oxigeno), o anaerobias (en ausencia de oxigeno), las reacciones proseguirán por una vía, o bien, se detendrán a cierto nivel.

La mitocondria, es un pequeño organelo celular en donde se llevan a cabo las reacciones que requieren la presencia de oxigeno. En la mitocondria se hallan numerosas enzimas que hacen posible la oxidación de los metabolitos del ciclo de Krebs.

La oxidación puede implicar: ganancia de oxigeno, perdida de hidrogeno, o mas específicamente, perdida de electrones.

La producción de energía por parte de la mitocondria, implica el transporte de electrones a lo largo de una cadena de reacciones y de varias maneras, una de ellas, es la colorimétrica, usando un aceptor artificial de electrones, el cual cambia de color cuando capta dichos electrones.


Para medirá con exactitud el grado en el cual se produce el cambio de color, se usara un aparato muy común en el laboratorio de bioquímica, el espectrofotómetro.

Sin entrar en muchos detalles, este aparato nos mide la cantidad de luz que atraviesa un medio coloreado (trasmitancia), o bien, nos puede medir la cantidad de luz que es retenida o absorbida por ese medio coloreado (absorbancia).

A mayor cantidad de substancias coloreadas tenga una muestra, mayor cantidad de luz será capaz de absorber, pero ello también dependerá del espesor de la cubeta (los tubos de cuarzo donde se colocan las muestras dentro del aparato).

Para el caso de la práctica, se usará como aceptor artificial de electrones al ferrocianuro (se usará ferrocianuro de potasio).

Esta substancia es de color amarillo, y a medida que va aceptando electrones, va haciéndose cada vez más pálida. A mayor cantidad de electrones aceptados, más pálida se vulva la solución, esta disminución de color se puede mediar con gran exactitud usando el espectrofotómetro.

MATERIALES REACTIVO

4 tubos de ensayo 120 x 10mm
1 gradilla
3 pipetas de 1ml
2 pipetas de 0.1ml

2 vasos p.p. 250ml
1 termómetro

1 baño Maria
1 mortero y mano
1 centrifuga con tubos

1 trozo de gasa
1 espectrofotómetro con cubetas
1 licuadora





Buffer de fosfatos pH 7.4 0.1M

Succinato en buffer 0.01M

Malonato en buffer 0.01M

Cianuro de potasio

Ferrocianuro de potasio 0.01M

Ácido tricloroacético al 10%


hielo picado


MATERIAL BIOLÓGICO
Trozo de corazón de res (fresco).


DESARROLLO DEL EXPERIMENTO.

1. Pese 10 gramos de corazón de res fresco (puede ser de otra especie).

2. Pique finamente el trozo de corazón, añada 190ml de buffer de fosfatos bien frío.

3. Coloque en un vaso licuador y licue por 1 minuto.

4. Filtre a través de gasa fina y recoja el filtrado en un vaso de precipitados.

5. Coloque en baño Maria de hielo el vaso de precipitados que contiene el filtrado (homogenizado).

6. Numere 3 tubos de ensayo y proceda como muestra el esquema:



                                                          Tubo 1              Tubo 2                         Tubo 3



Buffer de fosfatos                             3ml                      2ml                              1.9ml

Succinato en buffer                                                       1ml                              1ml

Malonato en buffer                                                                                          0.1ml

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Homogenizado del paso No 5           1 ml                      1 ml                             1 ml

NOTA: Checar que esté bien mezclado.

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Cianuro de potasio                          1 gota                   1 gota                           1 gota

7. Colocar los tubos en un baño Maria a 37°C por 5 minutos.


8. Añadir a cada tubo 1ml de ferrocianuro de potasio. Mezcle bien, anotar el tiempo al que se hizo la adición.

9. Diez minutos después agregue a cada tubo 5ml de ácido tricloroacético. Mezcle bien.

10. Centrifugue cada tubo por 5 minutos a 2,000 r.p.m.

11. Obtenga el sobrenadante de cada tubo y tome la lectura de la absorbancia en el espectrofotómetro, a una longitud de onda de 420nm. NOTA: UTILICE AGUA DESTILADA COMO BLANCO PARA CALIBRAR EL APARATO.


12. Calcule el numero de micromoles de ferrocianuro que quedan en cada tubo, para ello considere lo siguiente:

a) La Extinción molar (E) del ión ferrocianuro es de 1 X 10 3 litros mol -1 cm -1 a 420nm.

b) El volumen total en cada tubo, luego de la adición del ácido tricloroacético es de 10ml.

c) La longitud del rayo de luz que atraviesa la cubeta es de 1-1.2 cm. (Consulte a su instructor para el caso de las cubetas que usted está usando)


FORMULA A EMPLEAR PARA LOS CALCULOS

C = A
      EB


C = Concentración

A = Absorbancia medida en el espectrofotómetro

E = Extinción molar (1 X 10 3 mol -1 cm -1)

B = Espesor de la cubeta (cms)

Micromoles de Fe (CN) 3 al final de la reacción usados por el sistema



Tubo 1



Tubo 2



Tubo 3



12. Resultados esperados


Tubo 1. ------ No contiene el substrato (succinato), solo el buffer, de aquí que no exista oxidación, por lo tanto es el tubo que conserva más cantidad de ferrocianuro sin aceptar electrones (y sin cambiar de color).

Tubo 2. ------ La presencia del substrato (succinato), en este tubo, permite que dicho succinato se oxide, proceso que implica un transporte de electrones, los cuales son captados por el ferrocianuro, el cual se va decolorando a medida que ello ocurre. Este tubo debe dar el valor mas alto de micromoles de ferrocianuro empleados por el sistema enzimático y el menos numero de micromoles de ferrocianuro que quedan después de terminada la reacción.

Tubo 3. ------ La presencia del malonato que contiene este tubo, actúa como un inhibidor de tipo competitivo para la succinato deshidrogenasa (la enzima que cataliza la remoción de hidrogeno del succinato). Por lo tanto, el succinato al no oxidarse, se mantiene. Este tubo debe dar, en base a lo señalado, un valor de micromoles de ferrocianuro que quedan después de la prueba, mayor al del tubo No 2.

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