martes, 16 de agosto de 2011

PRACTICA DE BIOQUIMICA PARA VETERINARIA No 11 EXTRACCIÓN DE COLESTEROL A PARTIR DE YEMA DE HUEVO

A REALIZARSE SEMANA 24 A 28 MARZO 2014

AVISO IMPORTANTE: A PARTIR DE OCTUBRE DE 2013 POR ACUERDO DE ACADEMIA, SE MODIFICÓ LA PRÁCTICA, YA NO SE AISLARA EL COLESTEROL DESDE CEREBRO, SINO DESDE HUEVO DE GALLINA, EL PROCEDIMIENTO AQUI DESCRITO REEMPLAZA AL ANTERIOR.




EXTRACCION DE COLESTEROL A PARTIR DE YEMA DE HUEVO.


OBJETIVO:
El alumno, aprovechando las propiedades de solubilidad de los lípidos en solventes orgánicos, extraerá y cuantificará el colesterol a partir de una muestra
de yema de huevo de gallina.


INFORMACIÓN GENERAL
Los lípidos son una familia muy heterogénea de substancias en cuanto a su composición química; sin embargo, casi todos comparten una propiedad común, ser solubles en solventes orgánicos (éter, cloroformo, acetona etc.).


Existen 3 grupos fundamentales de lípidos:
1.- Simples: formados por la unión de un alcohol y un ácido graso (grasas, aceites, ceras).

2.- Compuestos: además de alcohol y ácidos grasos, contiene en su molécula otra sustancia, por ejemplo los fosfolípidos (contiene fósforo en su molécula)

3.- Derivados: de estructura muy variable y compleja, derivan de una estructura básica repetitiva llamada unidad isoprenoide. Ejemplo: El colesterol.

El colesterol es un compuesto de tipo lipídico, que solo existe en los productos de origen animal; los vegetales no contienen colesterol. El colesterol se halla en numerosos alimentos (el huevo es uno de ellos), pero aún cuando nos alimentemos con aquellos alimentos que no lo contengan, siempre abría colesterol en nuestro cuerpo, o en el de los animales, dado que el hígado lo produce, y otras células también, de aquí que este ampliamente difundido en muchas células del cuerpo.

El colesterol realiza constantes funciones dentro del organismo, pero su exceso puede llegar a ser perjudicial  pues puede acumularse en el interior de los vasos sanguíneos, reduciendo la luz de los mismos (arteriosclerosis).

Para la presente práctica se extraerá y cuantificará el contenido de colesterol presente en la yema de un huevo, para el caso del huevo de gallina, la yema representa entre el 30 al 40% del peso del huevo, y la cantidad promedio total de colesterol en cada yema es de aproximadamente 250 miligramos.



MATERIALES y EQUIPO

Espectrofotómetro
Centrífuga
10 tubos ensayo de vidrio de 12ml
2 vaso precipitados 100 ml
1 vaso precipitados 50 ml
1 Varilla de vidrio
1 Probeta de 25 ml
1Gradilla
1Pinza para tubo de ensayo
1Chispa
1 Tripié
1 tela asbesto
1 Mechero Bunsen
1 Termómetro
3 pipetas 1 ml
4 pipetas  10 ml
3 pipetas  5 ml
3 tapones de goma  para tubo ensayo


MATERIAL BIOLÓGICO
1 huevo de gallina.


REACTIVOS

Acetona
Éter etílico
Ácido sulfúrico concentrado
Cloruro férrico
Colesterol

DESARROLLO DEL EXPERIMENTO:

I.- Preparación de la curva de calibración.

1.-Preparar soluciones patrón de colesterol que contengan: 0.75, 1.5, 2.25, 3 y 3.75 miligramos por mililitro, que serán los patrones 1, 2, 3, 4 y 5 respectivamente.

2.-Usando seis  tubos de ensayo de 12 ml, proceda según se muestra en la siguiente tabla




TUBO
1
(blanco)
TUBO
2
TUBO
3
TUBO
4
TUBO
5
TUBO
6
Solución Patrón
0.75 mg/ml

6 ml




Solución Patrón
1.5 mg/ml
              

6ml



Solución Patrón
2.25 mg/ml



6ml


Solución Patrón
3 mg/ml




6ml

Solución Patrón
3.75 mg/ml





6ml
Ácido sulfúrico concentrado
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml

3.-Tape los tubos con tapón de goma

4.-Homogenize las soluciones por inversión suave

5.-Deje reposar por 25 minutos a temperatura ambiente

6.-Usando un espectrofotómetro determine la absorbancia de cada tubo a una longitud de onda de 540 nm. Utilice el blanco para calibrar el aparato a cero.

7.-Registre y anote las lecturas obtenidas para cada uno de los 5 tubos patrón.


Curva de Calibración


Tubo1 blanco

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6
Concentración de Colesterol (mg)

cero

0.75

1.5

2.25

3

3.75

Absorbancia











8.-Elabore una gráfica o curva de calibración en Microsoft  Excell,  que relacione la absorbancia  contra la concentración de colesterol.




II.- Extracción y cuantificación de colesterol de yema de huevo.

1.-Rompa un huevo de gallina y con cuidado separa la clara de la yema.

2.-Deseche la clara y conserve la yema.

3.-Pase la yema a un vaso de precipitados de 100 ml, rompa la membrana que la protege.

4.-Con una pipeta tome aprox. 0.5 ml de yema o si no es posible que la tome con pipeta pese aproximadamente 0.2 gramos de yema (en un vaso de precipitados de 50 ml).

5.-Mida con probeta 10 ml de una mezcla acetona: éter (1:1) añádalos al vaso de precipitados que contiene los 0.2 gramos (ó 0. 5 ml) de yema y agite constantemente con una varilla de vidrio durante 10 minutos.

6.-Pase el contenido del vaso de precipitados a un tubo de ensayo de vidrio.

7.-Centrifugue por 5 minutos a 3000 rpm.

8.-Sacar el tubo y colóquelo en una gradilla

9.-Tome un tubo de ensayo y rotúlelo como tubo “blanco”, añádale 0. 5 ml de la mezcla de solventes (acetona/éter).

10.-Tome un segundo tubo de ensayo de 12 ml y rotúlelo como tubo “prueba”, añádale  0. 5 ml del sobrenadante que contiene el tubo que centrifugó

11.-Usando el vaso de precipitados de 100 ml prepare un baño maría a 60°C.

12.-Verifique con termómetro que el agua está a 60°C, introduzca dentro del vaso de precipitados los tubos rotulados “blanco” y “prueba”.

13.-Mantenga la temperatura a 60°C hasta que se evapore el líquido (los 0.5 ml) de cada uno de los tubos.

14.-Cuando ya se haya evaporado el líquido, añada a cada tubo 6 ml de cloruro férrico (sin sacarlos del baño maría de preferencia)

15.-Llevar la temperatura del baño maría hasta el punto de ebullición (100°C) y  mantener los tubos por 5 minutos.

16.-Sacar los tubos con la pinza, enfrié bajo el chorro de agua.

17.-Con cuidado con una pipeta de 5 ml, añadir 2 ml de H2SO4 (ácido sulfúrico concentrado) por las paredes a cada tubo. CUIDADO ES MUY CAUSTICO, USE UN BULBO O PERILLA PARA PASAR EL ACIDO A LA PIPETA.

18.-Tape los tubos con tapón de goma

19.-Con inversión suave (No lo agite de más) homogenice las soluciones

20.-Deje reposar por 25 minutos a temperatura ambiente.

21.-Pasados los 25 minutos, deposite una muestra de cada uno de los tubos en cubetas para espectrofotómetro.

22.-Use el tubo “blanco” para calibrar a cero el aparato a 540 nm.

23.-Tome la lectura al tubo “prueba”, anote el valor de absorbancia obtenido.

24.-Interpole su valor obtenido con los valores  de la curva de calibración, de esta forma obtendrá la concentración de colesterol.








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