martes, 16 de agosto de 2011

AVISO MUY IMPORTANTE

BIENVENIDOS ALUMNOS Y MAESTROS AL BLOG DE LAS PRACTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA PARA VETERINARIA CURSO ESPECIAL ENERO 2014.

MAESTR@S TOMAR EN CUENTA QUE DESDE EL SEMESTRE AGOSTO-DICIEMBRE DE 2011 SE MODIFICÓ LA SECUENCIA U ORDEN EN QUE SE VAN A REALIZAR LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO, LA SECUENCIA MOSTRADA AQUI ES LA ACTUAL.

LAS PRACTICAS SON LAS MISMAS QUE SE HAN REALIZADO EN CURSOS ANTERIORES SE MODIFICÓ EL ORDEN DE REALIZACIÓN PARA ALGUNAS DE ELLAS Y SE ACTUALIZÓ LA PRÁCTICA DE COLESTEROL A PARTIR DE AGOSTO DE 2013, YA ESTA LA ACTUAL SUBIDA EN ESTE BLOG.

PONER ATENCIÓN A QUE EL NÚMERO QUE TIENE LA PRÁCTICA ASIGNADO REPRESENTA LA SECUENCIA EN QUE SE VA A REALIZAR, SE SEÑALA A LA VEZ LA FECHA EN QUE DEBE DE REALIZARSE LA PRÁCTICA

SE TRABAJA UNA PRÁCTICA POR SEMANA EXCEPTO SEMANA 3 AL 7 MARZO 2014 QUE SE REALIZARAN DOS PRÁCTICAS

 NO ESTA PERMITIDO ALTERAR LA SECUENCIA NI HACER MAS DE UNA PRÁCTICA SALVO CAUSAS JUSTIFICADAS (ENFERMÓ MAESTRO, SALIO FUERA, FUÉ DIA NO HÁBIL)

PRACTICA DE BIOQUIMICA PARA VETERINARIA No 13. VITAMINAS: DETERMINACION DE LA VITAMINA C EN LA ORINA

A REALIZARSE LA SEMANA 7 AL 11 ABRIL 2014



VITAMINAS: DETERMINACION DE LA VITAMINA C EN LA ORINA

OBJETIVO:

El alumno cuantificara loa cantidad de ácido ascórbico (vitamina c) excretada en la orina, por el método de Tillmans.

INFORMACION GENERAL

La vitamina c o ácido ascórbico, es una vitamina hidrosoluble, ampliamente distribuida en los vegetales verdes, y en las frutas sobre todo en las llamadas cítricos como limón, naranja, etc.). Es altamente soluble en agua, pero muy inestable. Puede formar cristales incoloros, con un punto de fusión de 190-192 °C.

La vitamina C es sintetizada por todos los animales domésticos, excepto por el cobayo. El hombre al igual que el cobayo, carece de la enzima clave para efectuar la síntesis de la vitamina, (la 1-L gunolactona oxidasa), de aquí que en la dieta que consume el hombre, deba estar presente la vitamina para evitar deficiencias.

La deficiencia de vitamina C en el hombre, produce la enfermedad conocida como escorbuto, la cual era bastante común hace algunos años (sobre todo en los marineros), cuando se desconocían las causas de esta enfermedad. El escorbuto se manifiesta por lesiones en las encías principalmente, se produce un agrietamiento de estas, debido a que la vitamina c es necesaria para la formación de colágeno.

La vitamina c aumenta la capacidad respuesta del sistema inmune de los animales.

Otras funciones que desempeña la vitamina, es la de actuar como reductor (en esta propiedad se basa el método para detectarla).

En el caso del hombre, la vitamina c como ya se mencionó, no se sintetiza, por lo tanto debe ingerirse con los alimentos que consumimos. En una dieta típica, existe mayor cantidad de vitamina que la que requerimos, y debido a que esta vitamina no puede almacenarse en el cuerpo, se elimina en la orina. La ingestión normal diaria para un adulto oscilara entre 20-80 mg/día, de los cuales un 50%se elimina en un periodo de 24 horas por la orina. En casos de deficiencia de vitamina c, o en infecciones severas, la vitamina pudiera o detectarse en orina.

FUNDAMENTO PARA LA DETERMINACION DE VITAMINA C

El ácido ascórbico es oxidado por el colorante 2,6 diclorofenolindofenol, a su vez este

colorante es reducido por el ácido ascórbico a un compuesto incoloro, pudiendo entonces calcular la cantidad de colorante reducido, la cual es proporcional a la cantidad de vitamina c presente en la orina.

Debido a que en la orina existen otras substancias que pudieran reducir al colorante, se acidificara la orina para que, si están presentes estas substancias, reaccionan muy lentamente con el colorante.


MATERIALES


Un vaso de p.p. 250ml

2 pipetas de 10 ml

2 pipetas 1 ml

1 vaso p.p 100 ml

1 embudo

1 agitador

1 bureta 25 ml

1 soporte para bureta

1 pinza para bureta

REACTIVOS

Acido acetico al 50 %

Colorante 2,6 diclofenol indofenol (80 mg/100 ml)


MATERIAL BIOLOGICO

Orina recién evacuada


DESARROLLO DEL EXPERIMENTO


1.- Medir en una probeta el total de orina excretada. Anotar dicho volumen.

2.- Pasar la orina a un vaso de precipitados, y añadirle una gota de ácido acético.


3.- En otro vaso de precipitados de 100ml añadir 0.5 ml de colorante 2,6 diclofenolindofenol.


4.-Colocar la orina del paso 2 en una bureta, y añadirla lentamente, gota a gota al vaso de precipitados que contiene un colorante, hasta que el color desaparezca.

5.- Anotar los mililitros de orina requeridos para reducir el colorante.

6.- Efectuar los cálculos de la vitamina c que se haya presente en la cantidad de orina recolectada. Considere que el colorante se haya preparado a una concentración de 80mg/100 ml y que la cantidad de vitamina C es directamente proporcional a la cantidad de colorante reducido.

PRACTICA DE BIOQUIMICA PARA VETERINARIA No. 12. ACIDOS NUCLEICOS: AISLAMIENTO DE ADN A PARTIR DE HEPATOCITOS

 A REALIZARSE SEMANA 31 MARZO A 4 ABRIL 2014

PRACTICA DE BIOQUIMICA PARA VETERINARIA No. 12




ACIDOS NUCLEICOS: AISLAMIENTO DE ADN A PARTIR DE HEPATOCITOS



OBJETIVO:




El alumno aislara el ácido nucleico desoxiribonucleico (ADN) a partir de células hepáticas (hepatocitos) e identificara por pruebas colororimétricas algunos de sus componentes básicos.



INFORMACIÓN GENERAL:



Existen 2 tipos principales de ácidos nucleicos: El ADN ( ácido desoxiribonucleico) y el ARN (acido ribonucleico).Los ácidos nucleicos son biopolímeros sumamente importantes dentro de las células, su principal función es participar en la síntesis de proteínas, y además, participar en los fenómenos de reproducción celular, en cuanto a su estructura química, los ácidos nucleicos constan de la unión de numerosos nucleótidos, estos nucleótidos estan formados por una base nitrogenada que puede ser ; purica ( adenina o guanina) o bien pirimidinica (citosina, timina o uracilo), constan también de un azúcar pentosa (ribosona o desoxirribosa ), y además fósforo.



El ácido desoxiribonucleico o ADN para el caso de las células eucarióticas se encuentra principalmente dentro del núcleo, aunque una pequeña porción del mismo se encuentra dentro de las mitocondrias, el ADN tiene una estructura tridimensional de una doble hélice, en la cual las bases nitrogenadas se encuentran siempre apareadas Guanina con Citosina y Adenina con Timina, se estima que el genoma humano haploide contiene alrededor de 3,000 millones de pares de bases.



Materiales Reactivos

Trozo de Hígado

Cuchillo

Licuadora

Gasa

Embudo Buchner

Bomba de vacío

Vaso pp 250 ml (2)

Varilla de vidrio

Probeta 50 ml (2)

3 tubos ensayo 10x12 mm

Pipeta Pasteur

3 pipetas 1 ml

Centrífuga

Tubos de polirtileno50 ml para centrífuga

Palillo de madera (largo)

Hielo



Sal común

Solución detergente sulfato lauril sódico

Proteasa

Alcohol etílico

Äcido sulfúrico

Reactivo de Bial

Molibdato de amonio

Reactivo de Fiske-Subarow







Desarrollo del experimento



1.-Pesar 50 gramos de hígado, cortarlo en trozos pequeños, pasarlos a un vaso de licuadora y añadir 100 ml de agua destilada fría más 10 gramos de sal común.



2.-Licuar a máxima velocidad por aproximadamente 30 segundos



3.-Filtrar a través de una capa fina de gasa colocada sobre un embudo Buchner, usar bomba de succión en caso de que sea necesario



4.-Pasar el filtrado a un vaso de precipitados de 250 ml y añadir 25 ml de solución detergente.



5.-Mezclar por 3 minutos lentamente y con cuidado el filtrado y la solución detergente usando una varilla de vidrio, IMPORTANTE TRATAR DE NO HACER ESPUMA AL MEZCLAR



5.-Dejar reposar la mezcla durante mínimo 10 minutos



6.-Pasar la mezcla a un tubo de ensayo llenando solamente 1/3 del volumen del tubo de ensayo y añadir una pizca o pequeña cantidad de enzima proteasa, agitar el tubo suavemente. PRECAUCIÓN SI SE AGITA CON VIOLENCIA SE VA A ROMPER EL ADN, VA A SER DIFICIL VERLO



7.-Ladear el tubo de ensayo y lentamente y por las paredes del tubo ir virtiendo alcohol etílico frío en una cantidad igual al volumen del filtrado que ya hay en el tubo.

PRECAUCION, LA ADICIÓN DEL ALCOHOL SE HACE LENTAMENTE Y POR LAS PAREDES DEL TUBO.



8.-Dejar reposar la mezcla por 30 minutos mínimo



9.- Colectar el ADN usando un palillo largo de madera para extraerlo del tubo





Resultados esperados



Si el procedimiento fue llevado a cabo de manera apropiada tal y como se describe en la práctica , observaras que el ADN (en forma de una sustancia blanca filamentosa, de aspecto viscoso) se desprendió de la muestra y se eleva hasta la superficie de la capa de alcohol, desde donde puede ser recuperada usando el palillo.



HIDRÓLISIS DEL ADN E IDENTIFICACIÓN DE SUS COMPONENTES





A.- IDENTIFICACIÓN DEL AZUCAR PENTOSA



1. Tome 0.2 gr. Del precipitado obtenido, colocarlo en un tubo de ensayo y añadirle 2 ml. De H2SO4 13 N.



2. Hierva a la flama del mechero ( suavemente ), agitando , durante 10 min.



3. Retire con una pipeta pasteur una pequeña porción del hidrolizado



4. Coloque 6 gotas del hidrolizado en un tubo de ensayo pequeño



5. Añada 0.5 ml de reactivo de Bial y agite.





RESULTADOS ESPERADOS



La presencia de azúcar pentosa ( desoxiribosa), que contiene el ADN, se manifiesta por la aparición de un color verde azuloso, debido a la reacción del furfural (producido al usar H2SO4 sobre el carbohidrato), mas el orcinol que contiene el reactivo de Bial.



B.- IDENTIFICACIÓN DE FOSFATO



1. Tome con una pipeta pasteur aprox. 1 ml del hidrolizado y pasarlos a un tubo de ensayo



2. Añada 0.5 ml. H2SO4 10 N y 1 ml. De molibdato de amonio al 2.5%



3. Añada 1 ml. De reactivo de fiske-subarow y dejar reposar 10 min.





RESULTADOS ESPERADOS



Se debe desarrollar un color azul, debido a la reacción del naftol-sulfonato sodio con el fosfato presente en el ADN (el naftol-sulfonatol es el principal componente del reactivo de Fiske-Subarow)

PRACTICA DE BIOQUIMICA PARA VETERINARIA No 11 EXTRACCIÓN DE COLESTEROL A PARTIR DE YEMA DE HUEVO

A REALIZARSE SEMANA 24 A 28 MARZO 2014

AVISO IMPORTANTE: A PARTIR DE OCTUBRE DE 2013 POR ACUERDO DE ACADEMIA, SE MODIFICÓ LA PRÁCTICA, YA NO SE AISLARA EL COLESTEROL DESDE CEREBRO, SINO DESDE HUEVO DE GALLINA, EL PROCEDIMIENTO AQUI DESCRITO REEMPLAZA AL ANTERIOR.




EXTRACCION DE COLESTEROL A PARTIR DE YEMA DE HUEVO.


OBJETIVO:
El alumno, aprovechando las propiedades de solubilidad de los lípidos en solventes orgánicos, extraerá y cuantificará el colesterol a partir de una muestra
de yema de huevo de gallina.


INFORMACIÓN GENERAL
Los lípidos son una familia muy heterogénea de substancias en cuanto a su composición química; sin embargo, casi todos comparten una propiedad común, ser solubles en solventes orgánicos (éter, cloroformo, acetona etc.).


Existen 3 grupos fundamentales de lípidos:
1.- Simples: formados por la unión de un alcohol y un ácido graso (grasas, aceites, ceras).

2.- Compuestos: además de alcohol y ácidos grasos, contiene en su molécula otra sustancia, por ejemplo los fosfolípidos (contiene fósforo en su molécula)

3.- Derivados: de estructura muy variable y compleja, derivan de una estructura básica repetitiva llamada unidad isoprenoide. Ejemplo: El colesterol.

El colesterol es un compuesto de tipo lipídico, que solo existe en los productos de origen animal; los vegetales no contienen colesterol. El colesterol se halla en numerosos alimentos (el huevo es uno de ellos), pero aún cuando nos alimentemos con aquellos alimentos que no lo contengan, siempre abría colesterol en nuestro cuerpo, o en el de los animales, dado que el hígado lo produce, y otras células también, de aquí que este ampliamente difundido en muchas células del cuerpo.

El colesterol realiza constantes funciones dentro del organismo, pero su exceso puede llegar a ser perjudicial  pues puede acumularse en el interior de los vasos sanguíneos, reduciendo la luz de los mismos (arteriosclerosis).

Para la presente práctica se extraerá y cuantificará el contenido de colesterol presente en la yema de un huevo, para el caso del huevo de gallina, la yema representa entre el 30 al 40% del peso del huevo, y la cantidad promedio total de colesterol en cada yema es de aproximadamente 250 miligramos.



MATERIALES y EQUIPO

Espectrofotómetro
Centrífuga
10 tubos ensayo de vidrio de 12ml
2 vaso precipitados 100 ml
1 vaso precipitados 50 ml
1 Varilla de vidrio
1 Probeta de 25 ml
1Gradilla
1Pinza para tubo de ensayo
1Chispa
1 Tripié
1 tela asbesto
1 Mechero Bunsen
1 Termómetro
3 pipetas 1 ml
4 pipetas  10 ml
3 pipetas  5 ml
3 tapones de goma  para tubo ensayo


MATERIAL BIOLÓGICO
1 huevo de gallina.


REACTIVOS

Acetona
Éter etílico
Ácido sulfúrico concentrado
Cloruro férrico
Colesterol

DESARROLLO DEL EXPERIMENTO:

I.- Preparación de la curva de calibración.

1.-Preparar soluciones patrón de colesterol que contengan: 0.75, 1.5, 2.25, 3 y 3.75 miligramos por mililitro, que serán los patrones 1, 2, 3, 4 y 5 respectivamente.

2.-Usando seis  tubos de ensayo de 12 ml, proceda según se muestra en la siguiente tabla




TUBO
1
(blanco)
TUBO
2
TUBO
3
TUBO
4
TUBO
5
TUBO
6
Solución Patrón
0.75 mg/ml

6 ml




Solución Patrón
1.5 mg/ml
              

6ml



Solución Patrón
2.25 mg/ml



6ml


Solución Patrón
3 mg/ml




6ml

Solución Patrón
3.75 mg/ml





6ml
Ácido sulfúrico concentrado
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml

3.-Tape los tubos con tapón de goma

4.-Homogenize las soluciones por inversión suave

5.-Deje reposar por 25 minutos a temperatura ambiente

6.-Usando un espectrofotómetro determine la absorbancia de cada tubo a una longitud de onda de 540 nm. Utilice el blanco para calibrar el aparato a cero.

7.-Registre y anote las lecturas obtenidas para cada uno de los 5 tubos patrón.


Curva de Calibración


Tubo1 blanco

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6
Concentración de Colesterol (mg)

cero

0.75

1.5

2.25

3

3.75

Absorbancia











8.-Elabore una gráfica o curva de calibración en Microsoft  Excell,  que relacione la absorbancia  contra la concentración de colesterol.




II.- Extracción y cuantificación de colesterol de yema de huevo.

1.-Rompa un huevo de gallina y con cuidado separa la clara de la yema.

2.-Deseche la clara y conserve la yema.

3.-Pase la yema a un vaso de precipitados de 100 ml, rompa la membrana que la protege.

4.-Con una pipeta tome aprox. 0.5 ml de yema o si no es posible que la tome con pipeta pese aproximadamente 0.2 gramos de yema (en un vaso de precipitados de 50 ml).

5.-Mida con probeta 10 ml de una mezcla acetona: éter (1:1) añádalos al vaso de precipitados que contiene los 0.2 gramos (ó 0. 5 ml) de yema y agite constantemente con una varilla de vidrio durante 10 minutos.

6.-Pase el contenido del vaso de precipitados a un tubo de ensayo de vidrio.

7.-Centrifugue por 5 minutos a 3000 rpm.

8.-Sacar el tubo y colóquelo en una gradilla

9.-Tome un tubo de ensayo y rotúlelo como tubo “blanco”, añádale 0. 5 ml de la mezcla de solventes (acetona/éter).

10.-Tome un segundo tubo de ensayo de 12 ml y rotúlelo como tubo “prueba”, añádale  0. 5 ml del sobrenadante que contiene el tubo que centrifugó

11.-Usando el vaso de precipitados de 100 ml prepare un baño maría a 60°C.

12.-Verifique con termómetro que el agua está a 60°C, introduzca dentro del vaso de precipitados los tubos rotulados “blanco” y “prueba”.

13.-Mantenga la temperatura a 60°C hasta que se evapore el líquido (los 0.5 ml) de cada uno de los tubos.

14.-Cuando ya se haya evaporado el líquido, añada a cada tubo 6 ml de cloruro férrico (sin sacarlos del baño maría de preferencia)

15.-Llevar la temperatura del baño maría hasta el punto de ebullición (100°C) y  mantener los tubos por 5 minutos.

16.-Sacar los tubos con la pinza, enfrié bajo el chorro de agua.

17.-Con cuidado con una pipeta de 5 ml, añadir 2 ml de H2SO4 (ácido sulfúrico concentrado) por las paredes a cada tubo. CUIDADO ES MUY CAUSTICO, USE UN BULBO O PERILLA PARA PASAR EL ACIDO A LA PIPETA.

18.-Tape los tubos con tapón de goma

19.-Con inversión suave (No lo agite de más) homogenice las soluciones

20.-Deje reposar por 25 minutos a temperatura ambiente.

21.-Pasados los 25 minutos, deposite una muestra de cada uno de los tubos en cubetas para espectrofotómetro.

22.-Use el tubo “blanco” para calibrar a cero el aparato a 540 nm.

23.-Tome la lectura al tubo “prueba”, anote el valor de absorbancia obtenido.

24.-Interpole su valor obtenido con los valores  de la curva de calibración, de esta forma obtendrá la concentración de colesterol.








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