PRACTICA DE BIOQUÍMICA PARA VETERINARIA No 10 OXIDACION MITOCONDRIAL DEL SUCCINATO

A REALIZARSE LA SEMANA 19 A 23 DE OCTUBRE DE 2015



OXIDACION MITOCONDRIAL DEL SUCCINATO

OBJETIVO


El alumno demostrara la oxidación mitocondrial del succinato, utilizando un aceptor artificial de electrones, la cantidad del cual será determinada por espectrofotometría.


INFORMACION GENERAL

Los animales superiores son heterótrofos, es decir, no pueden sintetizar su propia energía (como lo hacen las plantas en la fotosíntesis), sino que deben ingerir esa energía en los alimentos que consumen, y posteriormente extraer parte de la misma mediante una compleja serie de reacciones bioquímicas.


La principal fuente de energía para los animales y el hombre son los carbohidratos, el metabolismo energético de estos compuestos incluye reacciones como la glucólisis, ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. Dependiendo de si las condiciones microambientales son aerobias (con presencia de oxigeno), o anaerobias (en ausencia de oxigeno), las reacciones proseguirán por una vía, o bien, se detendrán a cierto nivel.

La mitocondria, es un pequeño organelo celular en donde se llevan a cabo las reacciones que requieren la presencia de oxigeno. En la mitocondria se hallan numerosas enzimas que hacen posible la oxidación de los metabolitos del ciclo de Krebs.

La oxidación puede implicar: ganancia de oxigeno, perdida de hidrogeno, o mas específicamente, perdida de electrones.

La producción de energía por parte de la mitocondria, implica el transporte de electrones a lo largo de una cadena de reacciones y de varias maneras, una de ellas, es la colorimétrica, usando un aceptor artificial de electrones, el cual cambia de color cuando capta dichos electrones.


Para medirá con exactitud el grado en el cual se produce el cambio de color, se usara un aparato muy común en el laboratorio de bioquímica, el espectrofotómetro.

Sin entrar en muchos detalles, este aparato nos mide la cantidad de luz que atraviesa un medio coloreado (trasmitancia), o bien, nos puede medir la cantidad de luz que es retenida o absorbida por ese medio coloreado (absorbancia).

A mayor cantidad de substancias coloreadas tenga una muestra, mayor cantidad de luz será capaz de absorber, pero ello también dependerá del espesor de la cubeta (los tubos de cuarzo donde se colocan las muestras dentro del aparato).

Para el caso de la práctica, se usará como aceptor artificial de electrones al ferrocianuro (se usará ferrocianuro de potasio).

Esta substancia es de color amarillo, y a medida que va aceptando electrones, va haciéndose cada vez más pálida. A mayor cantidad de electrones aceptados, más pálida se vulva la solución, esta disminución de color se puede mediar con gran exactitud usando el espectrofotómetro.

MATERIALES REACTIVO

4 tubos de ensayo 120 x 10mm
1 gradilla
3 pipetas de 1ml
2 pipetas de 0.1ml

2 vasos p.p. 250ml
1 termómetro

1 baño Maria
1 mortero y mano
1 centrifuga con tubos

1 trozo de gasa
1 espectrofotómetro con cubetas
1 licuadora





Buffer de fosfatos pH 7.4 0.1M

Succinato en buffer 0.01M

Malonato en buffer 0.01M

Cianuro de potasio

Ferrocianuro de potasio 0.01M

Ácido tricloroacético al 10%


hielo picado


MATERIAL BIOLÓGICO
Trozo de corazón de res (fresco).


DESARROLLO DEL EXPERIMENTO.

1. Pese 10 gramos de corazón de res fresco (puede ser de otra especie).

2. Pique finamente el trozo de corazón, añada 190ml de buffer de fosfatos bien frío.

3. Coloque en un vaso licuador y licue por 1 minuto.

4. Filtre a través de gasa fina y recoja el filtrado en un vaso de precipitados.

5. Coloque en baño Maria de hielo el vaso de precipitados que contiene el filtrado (homogenizado).

6. Numere 3 tubos de ensayo y proceda como muestra el esquema:



                                                          Tubo 1              Tubo 2                         Tubo 3



Buffer de fosfatos                             3ml                      2ml                              1.9ml

Succinato en buffer                                                       1ml                              1ml

Malonato en buffer                                                                                          0.1ml

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Homogenizado del paso No 5           1 ml                      1 ml                             1 ml

NOTA: Checar que esté bien mezclado.

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Cianuro de potasio                          1 gota                   1 gota                           1 gota

7. Colocar los tubos en un baño Maria a 37°C por 5 minutos.


8. Añadir a cada tubo 1ml de ferrocianuro de potasio. Mezcle bien, anotar el tiempo al que se hizo la adición.

9. Diez minutos después agregue a cada tubo 5ml de ácido tricloroacético. Mezcle bien.

10. Centrifugue cada tubo por 5 minutos a 2,000 r.p.m.

11. Obtenga el sobrenadante de cada tubo y tome la lectura de la absorbancia en el espectrofotómetro, a una longitud de onda de 420nm. NOTA: UTILICE AGUA DESTILADA COMO BLANCO PARA CALIBRAR EL APARATO.


12. Calcule el numero de micromoles de ferrocianuro que quedan en cada tubo, para ello considere lo siguiente:

a) La Extinción molar (E) del ión ferrocianuro es de 1 X 10 3 litros mol -1 cm -1 a 420nm.

b) El volumen total en cada tubo, luego de la adición del ácido tricloroacético es de 10ml.

c) La longitud del rayo de luz que atraviesa la cubeta es de 1-1.2 cm. (Consulte a su instructor para el caso de las cubetas que usted está usando)


FORMULA A EMPLEAR PARA LOS CALCULOS

C = A
      EB


C = Concentración

A = Absorbancia medida en el espectrofotómetro

E = Extinción molar (1 X 10 3 mol -1 cm -1)

B = Espesor de la cubeta (cms)

Micromoles de Fe (CN) 3 al final de la reacción usados por el sistema



Tubo 1



Tubo 2



Tubo 3

** Oxidación Mitocondrial del Succinato**

1.- ¿Qué es el succinato?

2.- Menciona las ventajas y desventajas de utilizar al oxígeno para obtener energía en los organismos superiores

3.- ¿Porqué en ésta práctica se utiliza como mejor material biológico al corazón? Explica tu respuesta

4.- ¿Porqué se considera al ciclo de Krebs y a la cadena de transporte de electrones  como metabolismo aerobio?

5.- ¿Quién actúa como inhibidor de la succinato deshidrogenasa y de qué manera lo hace?

6.- Menciona los 3 factores que en el ciclo de krebs activan a la succinato deshidrogenasa

PRACTICA DE BIOQUIMICA PARA VETERINARIA No 11 LIPIDOS

A REALIZARSE SEMANA 26 A 30 DE OCTUBRE DE 2015


PRACTICA DE BIOQUIMICA PARA VETERINARIA No 11 LIPIDOS

El término lípido se aplica a una gran variedad de compuestos químicamente muy heterogéneos, que comparten una propiedad física común, son insolubles en agua, pero son solubles en solventes orgánicos como éter, cloroformo, benceno etcétera. Los lípidos son componentes muy importantes en las células sobre todo como elementos estructurales en la composición de las membranas celulares ejemplo : fosfolípidos, pero también como compuestos metabólicos ejemplos: colesterol, vitamina A. Los lípidos se clasifican  en tres grandes grupos :

Lípidos simples.-aquellos que solo están formados por ésteres de alcohol y ácidos grasos

Lípidos compuestos.-aquellos que además del alcohol y ácido graso, poseen otro componente extra por ejemplo carbohidratos (se llamarían glucolípidos) fosfato (se llamarían fosfolípídos)

Lípidos derivados.- son aquellos ligeramente emparentados con un hidrocarburo llamado isopreno, por ello se les designa también como isoprenoides, en esta categoría entran sustancias como las vitaminas liposolubles (A,D, E, K) el colesterol y sus derivados, así como las hormonas esteroides.

Materiales

Aceite vegetal  15 ml

9 Tubos de ensayo 15 X 10 mm

1 Gradilla para tubos ensayo

1 Pinzas para tubo ensayo

1 Vaso precipitados 250 ml

1 Vaso precipitados 500ml

1 Mechero

1 Tela asbesto

1 Tripié

1 Chispa

7 pipetas 5 ml

1 probeta 25 ml

1 varilla vidrio aprox. 15 cms., longitud 3 mm diámetro

5 pipetas 2 ml

Reactivos

Hidróxido de sodio 5 gramos

Alcohol etílico    25 ml

Aceite vegetal  15 ml

Colesterol 100 miligramos

Acido sulfúrico concentrado  4 ml

Anhidrido acético 1 ml

Eter  40 ml

Cloroformo 6 ml

Benceno 6 ml

Cloruro calcio 0.5 gramos

Experimento uno.- Solubilidad de lípidos

1.-Prepare 3 tubos de ensayo rotulándolos y añadiendo las substancias según la siguiente tabla

Tubo	Aceite vegetal	Agua	Cloroformo	Benceno
1	2 ml	5 ml
2	2 ml		5 ml
3	2ml			5 ml
Coloque un tapón en cada tubo, y agite vigorosamente cada tubo para mezclar el contenido. Deje reposar los tubos en una gradilla durante 3 minutos , observe y anote sus observaciones para cada tubo ¿Se solubilizó el aceite en todos los tubos o solo en alguno o algunos?

Experimento dos.-Saponificación de lípidos

1.-Coloque en un vaso de precipitados de 250 ml, 5 ml de aceite vegetal

2.-Agregue 15 ml de solución alcohólica de hidróxido de sodio (NaOH)

3.-En un vaso de precipitados de 500 ml coloque 100 ml de agua, coloque el vaso en un soporte y ponga el vaso a la flama de un mechero hasta que el agua hierva.

4.-Cuando el agua este hirviendo introduzca  USANDO PINZAS el vaso de precipitados de 250 ml dentro del  vaso que contiene el agua en ebullición.

5.-Agite ocasionalmente con una varilla de vidrio el contenido del vaso de 250 ml hasta que se forme una masa semisólida

6.-Con la varilla de vidrio transfiera una pequeña porción de la masa de vaso de precipitados a un tubo de ensayo.

7.-Agregue 5 ml de agua al tubo de ensayo y agite vigorosamente. Observe que ocurre y anote sus observaciones

8.-En un tubo de ensayo diferente con la varilla de vidrio transfiera una pequeña porción de la masa del vaso de precipitados

9.- Agregue 5 ml de agua al tubo de ensayo NO LO AGITE AÚN.  Añada 1 ml de cloruro de calcio al tubo de ensayo y agite vigorosamente. Observe que ocurre y anote sus observaciones

Experimento tres.-Identificación del colesterol

a.-Prueba de Salkowski.

1.-Coloque en un tubo de ensayo 2 ml de una solución de colesterol medidos con una pipeta

2.- Con una pipeta Muy lentamente y con cuidado. NO LO ASPIRE CON BOCA USE UN BULBO añada 2 ml de ácido sulfúrico concentrado al tubo de ensayo.

Observe y anote el color obtenido.

b.-Prueba de Liebermann-Burchard

1.-Coloque en un tubo de ensayo 2 ml de una solución de colesterol medidos con una pipeta

2.-Añada con cuidado 10 gotas de anhídrido acético.

3.-Añada con cuidado 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado.

4.-Tape el tubo y agite muy suavemente para mezclar

Observe y anote el color obtenido.

Cuestionario

1.-Cuál es la razón por la que los lípidos son solubles en solventes apolares

2.-Que significa el término apolar aplicado a una molécula de lípido

3.-En el caso de los lípidos que es una molécula anfipática

4.-Defina lo que es la saponificación

5.-Explique porque en el caso del tubo del paso 9 del experimento de saponificación no se forma espuma

6.-Explique que cambios químicos (asociados a los cambios de color)  se producen en la molécula del colesterol en los casos de la reacción de Salkowski y de Lieberman-Burchard

PRACTICA DE BIOQUÍMICA PARA VETERINARIA No 12 AC.NUCLEICOS

A REALIZARSE LA SEMANA 2 A 6 DE NOVIEMBRE DE  2015


PRACTICA DE BIOQUÍMICA PARA VETERINARIA No. 12




ACIDOS NUCLEICOS: AISLAMIENTO DE ADN A PARTIR DE HEPATOCITOS



OBJETIVO:




El alumno aislara el ácido nucleico desoxiribonucleico (ADN) a partir de células hepáticas (hepatocitos) e identificara por pruebas colororimétricas algunos de sus componentes básicos.



INFORMACIÓN GENERAL:



Existen 2 tipos principales de ácidos nucleicos: El ADN ( ácido desoxiribonucleico) y el ARN (acido ribonucleico).Los ácidos nucleicos son biopolímeros sumamente importantes dentro de las células, su principal función es participar en la síntesis de proteínas, y además, participar en los fenómenos de reproducción celular, en cuanto a su estructura química, los ácidos nucleicos constan de la unión de numerosos nucleótidos, estos nucleótidos estan formados por una base nitrogenada que puede ser ; purica ( adenina o guanina) o bien pirimidinica (citosina, timina o uracilo), constan también de un azúcar pentosa (ribosona o desoxirribosa ), y además fósforo.



El ácido desoxiribonucleico o ADN para el caso de las células eucarióticas se encuentra principalmente dentro del núcleo, aunque una pequeña porción del mismo se encuentra dentro de las mitocondrias, el ADN tiene una estructura tridimensional de una doble hélice, en la cual las bases nitrogenadas se encuentran siempre apareadas Guanina con Citosina y Adenina con Timina, se estima que el genoma humano haploide contiene alrededor de 3,000 millones de pares de bases.



Materiales Reactivos

Trozo de Hígado

Cuchillo

Licuadora

Gasa

Embudo Buchner

Bomba de vacío

Vaso pp 250 ml (2)

Varilla de vidrio

Probeta 50 ml (2)

3 tubos ensayo 10x12 mm

Pipeta Pasteur

3 pipetas 1 ml

Centrífuga

Tubos de polirtileno50 ml para centrífuga

Palillo de madera (largo)

Hielo



Sal común

Solución detergente sulfato lauril sódico

Proteasa

Alcohol etílico

Äcido sulfúrico

Reactivo de Bial

Molibdato de amonio

Reactivo de Fiske-Subarow







Desarrollo del experimento



1.-Pesar 50 gramos de hígado, cortarlo en trozos pequeños, pasarlos a un vaso de licuadora y añadir 100 ml de agua destilada fría más 10 gramos de sal común.



2.-Licuar a máxima velocidad por aproximadamente 30 segundos



3.-Filtrar a través de una capa fina de gasa colocada sobre un embudo Buchner, usar bomba de succión en caso de que sea necesario



4.-Pasar el filtrado a un vaso de precipitados de 250 ml y añadir 25 ml de solución detergente.



5.-Mezclar por 3 minutos lentamente y con cuidado el filtrado y la solución detergente usando una varilla de vidrio, IMPORTANTE TRATAR DE NO HACER ESPUMA AL MEZCLAR



5.-Dejar reposar la mezcla durante mínimo 10 minutos



6.-Pasar la mezcla a un tubo de ensayo llenando solamente 1/3 del volumen del tubo de ensayo y añadir una pizca o pequeña cantidad de enzima proteasa, agitar el tubo suavemente. PRECAUCIÓN SI SE AGITA CON VIOLENCIA SE VA A ROMPER EL ADN, VA A SER DIFICIL VERLO



7.-Ladear el tubo de ensayo y lentamente y por las paredes del tubo ir virtiendo alcohol etílico frío en una cantidad igual al volumen del filtrado que ya hay en el tubo.

PRECAUCION, LA ADICIÓN DEL ALCOHOL SE HACE LENTAMENTE Y POR LAS PAREDES DEL TUBO.



8.-Dejar reposar la mezcla por 30 minutos mínimo



9.- Colectar el ADN usando un palillo largo de madera para extraerlo del tubo





Resultados esperados



Si el procedimiento fue llevado a cabo de manera apropiada tal y como se describe en la práctica , observaras que el ADN (en forma de una sustancia blanca filamentosa, de aspecto viscoso) se desprendió de la muestra y se eleva hasta la superficie de la capa de alcohol, desde donde puede ser recuperada usando el palillo.



HIDRÓLISIS DEL ADN E IDENTIFICACIÓN DE SUS COMPONENTES





A.- IDENTIFICACIÓN DEL AZUCAR PENTOSA



1. Tome 0.2 gr. Del precipitado obtenido, colocarlo en un tubo de ensayo y añadirle 2 ml. De H2SO4 13 N.



2. Hierva a la flama del mechero ( MUY suavemente ) y agitando. Retire cuando esté hirviendo



3. Retire con una pipeta pasteur una pequeña porción del hidrolizado



4. Coloque 6 gotas del hidrolizado en un tubo de ensayo pequeño



5. Añada 0.5 ml de reactivo de Bial y agite.




Observe el color desarrollado y anote sus resultados, investigue que reacción ocurrió entre la dosoxiribosa del ADN y el  orcinol del reactivo de Bial.



B.- IDENTIFICACIÓN DE FOSFATO



1. Tome con una pipeta pasteur aprox. 1 ml del hidrolizado y pasarlos a un tubo de ensayo



2. Añada 0.5 ml. H2SO4 10 N y 1 ml. De molibdato de amonio al 2.5%



3. Añada 1 ml. De reactivo de fiske-subarow y dejar reposar 10 min.

Observe el color desarrollado y anote sus resultados, investigue que reacción ocurrió entre el fosfato y el reactivo de Fiske-Subarow

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Cuestionario Aislamiento de ADN a partir de Hepatocitos” 

1.- Mencione las diferencias y las similitudes bioquímicas entre el ADN y el ARN

2.- ¿Qué función tiene el grupo fosfato dentro de la estructura del ADN?

3.- ¿Para qué se utiliza la sal en la extracción de ADN?

4.- ¿Qué importancia tiene el añadir la solución detergente? ¿Qué ocurre a nivel celular en este paso?

5.- ¿Para qué se añade la proteasa?

6.- Finalmente al añadir alcohol etílico frío, ¿Qué se intenta conseguir con esto?

7.-¿Cuál es el fundamento bioquímico de la prueba de Bial?

PRÁCTICA DE BIOQUÍMICA NO. 13 VITAMINAS

A REALIZARSE SEMANA 9 A 13 NOVIEMBRE DE 2015

PRÁCTICA NO. 13 VITAMINAS: DETERMINACIÓN DE LA VITAMINA C EN LA ORINA

OBJETIVO:

El alumno cuantificara loa cantidad de ácido ascórbico (vitamina c) excretada en la orina, por el método de Tillmans.

INFORMACION GENERAL

La vitamina c o ácido ascórbico, es una vitamina hidrosoluble, ampliamente distribuida en los vegetales verdes, y en las frutas sobre todo en las llamadas cítricos como limón, naranja, etc.). Es altamente soluble en agua, pero muy inestable. Puede formar cristales incoloros, con un punto de fusión de 190-192 °C.

La vitamina C es sintetizada por todos los animales domésticos, excepto por el cobayo. El hombre al igual que el cobayo, carece de la enzima clave para efectuar la síntesis de la vitamina, (la 1-L gunolactona oxidasa), de aquí que en la dieta que consume el hombre, deba estar presente la vitamina para evitar deficiencias.

La deficiencia de vitamina C en el hombre, produce la enfermedad conocida como escorbuto, la cual era bastante común hace algunos años (sobre todo en los marineros), cuando se desconocían las causas de esta enfermedad. El escorbuto se manifiesta por lesiones en las encías principalmente, se produce un agrietamiento de estas, debido a que la vitamina c es necesaria para la formación de colágeno.

La vitamina c aumenta la capacidad respuesta del sistema inmune de los animales.

Otras funciones que desempeña la vitamina, es la de actuar como reductor (en esta propiedad se basa el método para detectarla).

En el caso del hombre, la vitamina c como ya se mencionó, no se sintetiza, por lo tanto debe ingerirse con los alimentos que consumimos. En una dieta típica, existe mayor cantidad de vitamina que la que requerimos, y debido a que esta vitamina no puede almacenarse en el cuerpo, se elimina en la orina. La ingestión normal diaria para un adulto oscilara entre 20-80 mg/día, de los cuales un 50%se elimina en un periodo de 24 horas por la orina. En casos de deficiencia de vitamina c, o en infecciones severas, la vitamina pudiera o detectarse en orina.

FUNDAMENTO PARA LA DETERMINACION DE VITAMINA C

El ácido ascórbico es oxidado por el colorante 2,6 diclorofenolindofenol, a su vez este

colorante es reducido por el ácido ascórbico a un compuesto incoloro, pudiendo entonces calcular la cantidad de colorante reducido, la cual es proporcional a la cantidad de vitamina c presente en la orina.

Debido a que en la orina existen otras substancias que pudieran reducir al colorante, se acidificara la orina para que, si están presentes estas substancias, reaccionan muy lentamente con el colorante.


MATERIALES

Un vaso de p.p. 250ml

2 pipetas de 10 ml

2 pipetas 1 ml

1 vaso p.p 100 ml

1 embudo

1 agitador

1 bureta 25 ml

1 soporte para bureta

1 pinza para bureta

REACTIVOS

Acido acetico al 50 %

Colorante 2,6 diclofenol indofenol (80 mg/100 ml)


MATERIAL BIOLOGICO

Orina recién evacuada


DESARROLLO DEL EXPERIMENTO

1.- Medir en una probeta el total de orina excretada. Anotar dicho volumen.

2.- Pasar la orina a un vaso de precipitados, y añadirle una gota de ácido acético.


3.- En otro vaso de precipitados de 100ml añadir 0.5 ml de colorante 2,6 diclofenolindofenol.


4.-Colocar la orina del paso 2 en una bureta, y añadirla lentamente, gota a gota al vaso de precipitados que contiene un colorante, hasta que el color desaparezca.

5.- Anotar los mililitros de orina requeridos para reducir el colorante.

6.- Efectuar los cálculos de la vitamina c que se haya presente en la cantidad de orina recolectada. Considere que el colorante se haya preparado a una concentración de 80mg/100 ml y que la cantidad de vitamina C es directamente proporcional a la cantidad de colorante reducido.

CUESTIONARIO

1.- ¿Qué es oxidación?

2,. ¿Qué es reducción?

3.- Investigue en que se fundamenta el análisis cuantitativo denominado titulación o valoración

4.- Escriba la reacción completa de oxidación reducción del ácido ascórbico, señalando que compuestos se oxidan y cuales se reducen.